NobleRyder 一步克隆试剂盒
NobleRyder CLO01-20 一步克隆试剂盒 NobleRyder® One Step Cloning Kit 20TNobleRyder CLO01-50 一步克隆试剂盒 NobleRyder® One Step Cloning Kit 50TNobleRyder 一步克隆试剂盒
NobleRyder CLO01-20 一步克隆试剂盒 NobleRyder® One Step Cloning Kit 20T
产品品牌：NobleRyder
产品货号：CLO01-20
产品名称：一步克隆试剂盒
英文名称：NobleRyder® One Step Cloning Kit
产品规格：20T
NobleRyder 一步克隆试剂盒
产品简介：
NobleRyder® One Step Cloning Kit是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆技术，可以将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。可以高效兼容1-5个片段同源重组，50℃反应10 - 30 min即可进行连接，适用于快速克隆，DNA定点突变等。
组分 | CLO01-20 | CLO01-50 |
2×NobleRyder® One Step Cloning Mix | 100 μL | 250 μL |
700bp Control Insert (10ng/μL) pCold Control Vector,linearized(20ng/μL) | 5 μL 10 μL | 5 μL 10 μL |
实验流程
1.制备线性化载体
选择合适的克隆位点，并对载体进行线性化。尽量选择无重复序列且载体克隆位点上下游20bp区域内GC含量在40%-60%之间的位点进行克隆。载体线性化方式有限制性内切酶酶切消化和反向PCR扩增。1）酶切制备线性化载体时，推荐使用双酶切线性化，线性化wan全5.1 制备线性化载体
选择合适的克隆位点，对载体进行线性化。选择载体克隆位点附近无重复序列且上下游20bp区域内GC含量在40%-60%之间的位点进行克隆。
1）酶切制备线性化载体，推荐使用双酶切方案；单酶切线性化并不影响无缝链接，但可能会有更多的环状质粒残留，增加后期克隆的筛选难度。
2）反向PCR扩增制备线性化载体，必须使用高保真DNA聚合酶进行载体扩增，以减少扩增突变的引入。PCR产物需要进行胶回收，减少环状质粒环状DNA模板的残留。
2.制备插入片段
通过在插入片段正、反向引物5，端引入15-25bp线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5，端和3，端的末端分别带有与线性化载体的两个末端对应的wan全一致的序列。使用高保真PCR Mix完成扩增，获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳分析，并回收正确的产物片段。
插入片段正向扩增引物设计方式：
5’-上游载体末端同源序列+酶切位点（保留或删除）+基因特异性正向扩增引物序列-3’
插入片段反向扩增引物设计方式：
3’-基因特异性反向扩增引物序列+酶切位点（保留或删除）+下游载体末端同源序列-5’
3.线性化载体与插入片段浓度测定
使用NanoDrop或Qubit检测线性化载体和插入片段的浓度。
4.重组反应体系的配制
1）线性化载体和插入片段使用量计算
载体与插入片段摩尔比为1:2 ~ 1:3；当插入片段长度大于克隆载体时，将插入片段当作克隆载体，克隆载体当作插入片段计算。
2）在冰上配制反应体系：
组分 | 实验组 | 阴性对照 | 阳性对照 |
线性化载体 | X | X | pCold Control Vector,linearized 1 μL |
插入片段 | Y | 0 | 700bp Control Insert 1 μL |
2×NobleRyder® One Step Cloning Mix | 5 | 0 | 5 μL |
DNase-Free Water | to 10μL | to 10μL | to 10μL |
3） 使用移液器轻轻吸打混匀并瞬时离心。
4） 50℃反应20min， 4℃维持或取出后置于冰上冷却。
5） 重组反应转化、涂板，具体方法参照感受态细胞的说明书。
产品订购信息：
NobleRyder CLO01-20 一步克隆试剂盒 NobleRyder® One Step Cloning Kit 20T
NobleRyder CLO01-50 一步克隆试剂盒 NobleRyder® One Step Cloning Kit 50T
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