NobleRyder NP-40裂解液
NobleRyder NP-40裂解液NobleRyder NP-40裂解液 即用型液体试剂 P4810-100ml
NobleRyder NP-40裂解液
产品简介:
多种成分均可以从细胞中提取总蛋白,如 Triton、SDS、NP-40 等。NP-40 裂解液(NP-40 Lysis Buffer)是采用一种温和的裂解方法获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于 PAGE 电泳、 Western、免疫沉淀(Immunol Precipitation , IP)和免疫共沉淀(co-IP)等,并含有多种蛋白酶抑制剂成分,可有效抑制蛋白的降解,并维持原有的蛋白间相互作用。
NobleRyder NP-40 Lysis Buffer 主要由 Tris-HCl、NaCl、NP-40 以及 sodium pyropho-sphate,β-glycerophosphate,sodium fluoride, EDTA 等多种蛋白酶抑制剂组成。用NP-40 Lysis Buffer 得到的蛋白,可以用 BCA 蛋白定量试剂盒和 Bradford 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
产品组成:
编号 名称 | P4810 | Storage |
NP-40 Lysis Buffer | 100ml | -20℃ |
PMSF(100mM) | 1.5ml | -20℃ |
使用说明书 | 1份 |
操作步骤(仅供参考):
(一)贴壁培养细胞
1、取 NP-40 Lysis Buffer 置于室温溶解混匀,加入 PMSF,使 PMSF 终浓度为 1mM。
2、去除贴壁细胞的培养液,用 PBS、NS 或无血清培养液清洗 1 次,低速离心,弃上清,留取沉淀。
3、按照 6 孔板每孔加入 150~250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例,加入 NP-40 Lysis Buffer。移液器轻轻吹打,使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或 4℃裂解 15~30min,通常裂解液作用于细胞 1~3s内,细胞就会被裂解。
4、10000~12000g,4℃离心 5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。
5、进行后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)悬浮培养细胞
1、取 NP-40 Lysis Buffer 置于室温溶解混匀,加入 PMSF,使 PMSF 终浓度为 1mM。低速离心悬浮细胞,弃上清,收集沉淀。
2、用手指轻弹细胞,使其松散。按照 6 孔板每孔细胞加入 150~200μl 含有 PMSF 的裂解液的比例,加入 NP-40 Lysis Buffer 。通常 6 孔板每孔细胞加入 150μl 裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200~250μl。再用手指轻弹以充分裂解细胞,充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
3、10000~12000g,4℃离心 5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。
4、进行后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)组织样本
1、取 NP-40 Lysis Buffer 置于室温溶解混匀,加入 PMSF,使 PMSF 终浓度为 1mm。把组织jian切成细小的碎片,越小越好。
2、取在液氮或超低温冰箱中冷冻 30min 以上的组织,迅速用液氮研磨,研磨过程尽量控
制在 1~2min 之内,以减少蛋白的降解。
3、按照每 20mg 组织加入 150~250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的裂解液。冰上或 4℃裂解 30~60min。
4、 步骤 3、4 亦可以采用如下过程:按照每 20mg 组织加入 150~250μl 裂解液的比例,加入含有 PMSF 的 NP-40 Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆,直至充分裂解,该过程尽量控制在 1~2min 之内,以减少蛋白的降解。
5、10000~12000g,4℃离心 5~15min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。
6、进行后续的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事项:
1、在贴壁培养细胞的操作步骤中,去除贴壁细胞的培养液后,如果血清中的蛋白没有干扰,可以不用清洗。
2、如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。
3、在培养细胞的裂解中,如果细胞量较多,必需分装成 50~100 万细胞/离心管,然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分,而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触,相对比较容易裂解充分。
4、 如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈 Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
5、溶解 NobleRyder NP-40 Lysis Buffer 时,应尽量缩短溶解时间,避免裂解液中的有效成分失效。
6、细胞裂解的操作步骤,应置于冰上或 4℃进行。
7、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期:12个月有效。
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