Qiagen试剂盒提取总RNA的操作过程：
1、称取新鲜叶组织样品100 mg，液氮速冻。
2、在预冷的研钵中研磨成细粉，转移到2 ml离心管中。注意研磨不*则会造成严重产量降低。
3、待液氮挥发(但不能解冻)后，加入450 ml提取缓冲液RLT，涡旋混匀，并在56℃温育1~3 min。注意：在RLT临用前加入1/100体积的14.5 M β-巯基乙醇，加后保存时间不超过1个月，RLT溶液应在1个月内使用。对于高淀粉含量的材料，可将温度提高到60℃以上防止淀粉结块。
4、将裂解液加到离心柱(浅紫色柱)上，下接一个2 ml收集管，zui大转速离心2 min。如果将裂解液粘稠，可切去吸头顶端，用大口吸头吸取。裂解液通过柱子时被均质化，大部分组织碎片都被截留在柱子表面，只有少部分通过柱子形成沉淀，因此，应小心吸取上清液，转移到另一新离心管，不要吸细胞碎片残渣沉淀。
5、加入0.5倍体积(225 µL)96~99.99%乙醇，吹打混合均匀。如果裂解液有损失，则相应减少乙醇用量。加入乙醇后，可能会出现沉淀，但对提取无影响。
6、将混合液全部(包括沉淀675 µL)转移到吸附RNA的离心柱(粉红色柱)，下接一个2 ml收集管，大于8000 g或10000 r/min离心15 sec。如果混合液体积超过700 µL，每次只加700 µL到离心柱上，按上述条件离心。弃去管内液体，重复使用收集管。
7、加入700 µL洗脱液，大于8000 g或10000 r/min离心25 sec，弃去收集管。
8、将离心柱转移到一新的2 ml收集管上，加入500 µL RPE液，大于8000 g或10000 r/min离心15 sec。弃去管内液体，重复使用收集管。注意：Qiagen试剂盒提供浓缩的PRE洗脱液，所心使用前必须加入4倍体积的96~99.99%乙醇，成为工作液。
9、加入500 µL RPE液到离心柱上，zui大转速离心2 min，干燥离心柱，弃去收集管。残留乙醇会干扰随后的反应，这次离心要保证无乙醇残留。若有乙醇残留，以zui大转速离心1 min。
10、把离心柱连接到一新的1.5 ml收集管上，加入20~30 µL 无RNase水，大于8000 g或10000 r/min离心1 min，洗脱RNA。若RNA产量在20 μg以上，用30~50 µL无RNase水再洗脱一次。RNA样品存于-20℃或-80℃冰箱。
11、分光光度计测定RNA。开启紫外分光光度计，预热30 min。用DEPC处理水校正零点。用DEPC处理水稀释RNA样品30~50倍，将稀释液转移到比色杯中。读取230、260、280、310 nm的OD值。计算出样品浓度和OD比值。OD260/ OD280比值应为1.7~2.1，低于1.7，说明有蛋白质或酚污染;OD260/ OD230比值应大于2，低于此值，说明有糖、盐、胍等小分子污染。
12、琼脂糖凝胶甲醛变性电泳。首先制备凝胶(1.2%)。称取1.2 g琼脂糖，加72 ml DEPC处理的水，加热溶化。冷却至60℃，在通风橱内加入10×凝胶缓冲液10 ml，甲醛(37%)18 ml，混匀后倒胶。然后制备样品。在离心管中，将RNA样品与5×变性上样缓冲液按4:1比例混匀。65℃温育5~10 min，迅速在冰上冷却5 min，瞬时离心数秒。上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。以5 V/cm电压电泳1.5~2 hr。待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3~4/5处结束电泳。将凝胶置于溴化乙锭溶液(0.5 µg/mL，用0.1 mol/L乙酸胺配制)中当色约30 min。紫外灯下观察结果。
以上是Qiagen试剂盒提取总RNA的全部过程，如果您还有什么疑问，咨询北京诺博莱德科技有限公司。
